江蘇省理化測試中心馬慧娟、徐慧、高宏 食品安全導刊中提到銅綠假單胞菌檢測技術(shù)包括膜過濾法、熒光定量PCR法、LAMP法、酶底物法?！　?br />        國標濾膜法
　　檢測桶裝水中銅綠假單胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》。銅綠假單胞菌產(chǎn)色素分為三種：產(chǎn)綠膿菌素，產(chǎn)青膿素，產(chǎn)紅膿素；銅綠假單胞菌在4℃不生長而在42℃可以生長；具有氧化酶，可以使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物：可以產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，滴加納氏試劑（碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用，生成紅色絡合物；根據(jù)這些生化特性，通過濾膜過濾將銅綠假單胞菌富集到CN瓊脂上，再用生化試劑管進行生化鑒定。也可以用VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定系統(tǒng)用于微生物鑒定，準確率高，可用于微生物實驗室的日常檢測工作。
　　
　　實時熒光定量PCR檢測
　　外毒素 A 基因在銅綠假單胞菌中高度保守，根據(jù)銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，設計特異性引物及TaqMan探針，并利用實時熒光 PCR技術(shù)，對目標靶序列進行特異性擴增，建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，特異性試驗和靈敏性試驗良好，該檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎。
　　
　　LAMP檢測
　　環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（以下簡稱LAMP）：利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下進行反應，40min內(nèi)可完成核酸擴增，檢測過程不需要昂貴的儀器設備，簡單的水浴鍋即可，擴增產(chǎn)物不需要繁瑣的電泳過程，快速靈敏，特異性強，成本低，尤其適合大量、即時、現(xiàn)場的病原微生物的初篩，易于在基層推廣應用。
　　
　    銅綠假單胞菌快速檢測試劑（酶底物法）
酶底物法（Pseudalert）采用特異性固定底物技術(shù)，目標細菌產(chǎn)生能夠分解 Pseudalert 底物特定的酶，產(chǎn)生熒光，在24 h內(nèi)即可得到結(jié)果，無需進行驗證試驗，該方法能夠較好地彌補傳統(tǒng)濾膜法在檢測工作中的不足，在美國和歐洲部分地區(qū)已經(jīng)被批準為檢驗銅綠假單胞菌的標準方法。
其中，酶底物法已經(jīng)應用在GB5749-2006,生活飲用水標準和環(huán)境標準《HJ 1001-2018 水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》中。
        含菌量少的樣品需要先濃縮
         濃縮后定性檢測：取250ml包裝飲用水樣品，用不銹鋼過濾系統(tǒng)及無菌濾膜過濾，無菌操作取出濾膜，剪碎后放于無菌試管中，再加無菌水3毫升，放振蕩器中振蕩30-60秒。
吸取上清液轉(zhuǎn)移至100ml樣品瓶中，再加無菌水至100ml,再加入銅綠假單胞菌酶底物試劑，溶解后放入36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
        含菌量大的樣品可直接用無菌瓶取樣100ml,再加入銅綠假單胞菌酶底物試劑，溶解后放入36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
培養(yǎng)24小時后，在360nm紫外燈下觀察結(jié)果，藍色熒光表明存在銅綠假單胞菌。
       銅綠假單胞菌快速檢測試劑（酶底物法）定量檢測：如需定量檢測，可用定量盤配合程控封口機，根據(jù)定量盤上陽性樣本數(shù)查表格。
 
       實時熒光定量PCR檢測缺點：對儀器人員要求高，設備昂貴。對死菌不易鑒別，容易假陽性。
      LAMP法檢測缺點：需要離心機、恒溫金屬浴等設備，陽性對照容易污染實驗室引起假陽性。
       酶底物法特點：定性檢測無需特別人員，設備，只需要360nm紫外燈,紫外防護眼鏡、小型恒溫培養(yǎng)箱，大大減少飲用水廠人員設備投入。但如需定量檢測，需要程控封口機及定量盤，投入成本較高。
                       銅綠假單胞菌快速檢測試劑酶底物法配套產(chǎn)品：

銅綠假單胞菌酶底物法試劑	定性或者定量
100ml無菌瓶	含硫代硫酸鈉/不含硫代硫酸鈉
360nm紫外燈	熒光反應
紫外防護眼鏡	防止紫外線對眼睛傷害
小型恒溫培養(yǎng)箱	36℃-38℃
三聯(lián)不銹鋼過濾系統(tǒng)	膜過濾，濃縮
無菌濾膜	200張/盒 0.45μm
漩渦振蕩器	試管振蕩
程控封口機/定量盤	銅綠假單胞菌快速檢測試劑酶底物法（定量）

 
 
廈門敏測實驗器材公司即將推出銅綠假單胞菌快速檢測試劑盒（酶底物法）。敬請期待！