常見食源性微生物/細(xì)菌保藏方法
- 發(fā)布時(shí)間：2016-07-13
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八、常見食源細(xì)菌的保存方法
1．蠟樣芽孢桿菌
（1）短期保存
① 接種蠟樣芽孢桿菌于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面并于30℃～35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 在室溫條件下(21℃~23℃)繼續(xù)保持1d~2d以便于芽孢完全生成。
③ 在4℃條件下冷藏肉湯培養(yǎng)物。
（2）長(zhǎng)期保存
① 將蠟樣芽孢桿菌菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，在30℃~35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 在室溫條件下(21℃~23℃)繼續(xù)保持l d~2d，以便于芽孢完全生成。
③ 為了延緩細(xì)菌的生長(zhǎng)，可以用蒸餾水與20％的甘油氯化鈉溶液按l：1混合以后加到瓊脂斜面上。
制備甘油氯化鈉溶液：溶解4.2g的氯化鈉，并加入蒸餾水，使體積達(dá)到800mL。在溶液中加入12.4g的無水磷酸氫二鉀，4.0g無水磷酸二氫鉀和200mL甘油。調(diào)整pH值至7.2，121℃，滅菌5min。
④ 將3mL 1：1的混合液迅速放入干冰中或超低溫冷凍箱內(nèi)進(jìn)行冷凍，溫度設(shè)定在-55℃到-90℃。
⑤ 每?jī)赡辏瓷戏ㄟM(jìn)行培養(yǎng)。
2．空腸彎曲桿菌
所有的培養(yǎng)過程必須使用微需氧的空氣環(huán)境：氮?dú)庹?5％，二氧化碳占l0％，氧氣占5％。
（1）短期保存
① 接種裝有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化鈉肉湯。
配制方法： 20g酸水解酪素（casamino acid）、6g酵母浸膏、2.5g氯化鈉和 8.7lg無水磷酸氫二鉀，補(bǔ)足蒸餾水至1L。121℃，15min滅菌。調(diào)整pH值，使其在滅菌后為8.5±0.2。
② 將接種過的培養(yǎng)基在41℃~44℃培養(yǎng)48 h±2h。
③ 在巧克力瓊脂或血瓊脂斜面上進(jìn)行劃線，41℃~44℃培養(yǎng)48h±2h。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種裝有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化鈉肉湯，于4l℃~44℃培養(yǎng)48h±2h。
② 在培養(yǎng)物內(nèi)加入甘油，使最終濃度達(dá)到10％~20％。
③ 分裝2mL~3mL，于-70℃或更低溫度進(jìn)行冷凍。
④ 每6個(gè)月傳代一次。
3．肉毒梭菌
（1）短期保存
① 接種脫氣后的裝有皰肉培養(yǎng)基或含胰蛋白酶的胰酪胨－蛋白胨－葡萄糖－酵母浸膏肉湯（Trypticase-peptone-glucose-yeast extract broth,TPGYT），根據(jù)不同菌株選擇26℃或35℃培養(yǎng)，26℃適于蛋白水解的A、B、F和G群，而35℃適于非蛋白水解的B、E和F群。
制備皰肉培養(yǎng)基：在12.5g的市售培養(yǎng)基內(nèi)加入100mL冷卻的蒸餾水。混合后保持15min，以便使里面所有顆粒都能濕透。另一種辦法是分裝1.25g市售培養(yǎng)基到20mm×150mm的試管內(nèi)，加入10mL涼的蒸餾水，混合均勻，使所有顆粒都浸透。121℃，滅菌20min。最終的pH值為7.2±0.2。
TPGYT培養(yǎng)基無法買到，須用各種不同的原料自己配制。配制過程是在1L蒸餾水內(nèi)溶解以下原料：50g胰酪胨、5g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖和lg硫乙醇酸鈉。分裝15mL到20mm×150mm的試管內(nèi)，121℃，滅菌10min。最終的pH值為7.0±0.2。冷藏滅菌后的培養(yǎng)基，在使用之前加入胰蛋白酶（trypsin）。
制做胰蛋白酶溶液：將1.5g的胰蛋白酶(1：250，Difco)加入100mL蒸餾水中。攪拌水中的胰蛋白酶使其懸起，讓顆粒沉淀，用0.45μm的濾膜過濾上清液。使用之前蒸煮上述基礎(chǔ)液10min，排出溶解氧。在每15mL基礎(chǔ)液里加入1mL胰蛋白酶溶液。
② 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌所要求的溫度，培養(yǎng)5天或更長(zhǎng)時(shí)間。
③ 在4℃可保存6個(gè)月。
（2）長(zhǎng)期保存
① 按上述方法培養(yǎng)細(xì)菌。
② 用無菌的離心管盛TPGYT培養(yǎng)物離心，沉淀細(xì)菌芽孢。
③ 用10mL~20mL無菌蒸餾水沖洗細(xì)菌芽孢兩次。
④ 用無菌蒸餾水重懸洗過的芽孢，將其儲(chǔ)存于4℃。
⑤ 細(xì)菌芽孢懸液能穩(wěn)定保存10年～20年。
4．產(chǎn)氣莢膜梭菌
（1）短期保存
① 試管內(nèi)裝入10mL新脫氣過的液體硫乙醇酸鹽肉湯，接種入產(chǎn)氣莢膜梭菌，在35℃~37℃厭氧條件下培養(yǎng)18h～20h。
② 再將細(xì)菌接入脫氣后的皰肉培養(yǎng)基，在35℃~37℃有氧條件下培養(yǎng)24h±2h。
③ 在室溫環(huán)境(21℃~23℃)再培養(yǎng)1d~2d，使芽孢充分形成。
④ 在4℃條件下冷藏肉湯培養(yǎng)物。
⑤ 每30天進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種產(chǎn)氣莢膜梭菌到胰酪胨-蛋白胨-葡萄糖-酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基。
配制方法：將50.0g胰酪胨、5.0g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖、5g磷酸氫二鈉和lg硫乙醇酸鈉溶解到1L蒸餾水中。調(diào)整pH值為7.3±0.2，分裝15mL到20mm×150mm的試管內(nèi)，121℃，滅菌8min。使用之前將滅菌后的培養(yǎng)基冷藏保存。
② 將接種過的培養(yǎng)基于35℃~37℃培養(yǎng)18h。
③ 按1:1的量將肉湯培養(yǎng)物加入到脫脂奶中，取lmL～2mL進(jìn)行凍干?；蛘甙?:1的量將肉湯培養(yǎng)物加入到10％甘油氯化鈉溶液中。甘油氯化鈉溶液的制備：溶解4.2g氯化鈉到900mL蒸餾水中。然后加入12.2g無水磷酸氫二鉀、4g無水磷酸二氫鉀和100mL甘油。調(diào)整pH值到7.2±0.2，然后在121℃，滅菌15min。
④ 取1mL～3mL1:1的培養(yǎng)物混合物，放入固體干冰中和超低溫冰箱中保存，溫度為-55℃～-90℃。
⑤ 每?jī)赡陚鞔淮巍?/span>
5．大腸桿菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌接種到腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 在4℃冷藏斜面培養(yǎng)物。
③ 每月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 將細(xì)菌接種到腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24±2h。
② 將上述培養(yǎng)物接種到l0mL腦心浸液中。
③ 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，時(shí)間為24±2h。
④ 離心培養(yǎng)液，然后用l0mL巴氏磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞兩遍。
⑤ 用10mL巴氏磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞。
⑥ 在一份沖洗過的細(xì)胞懸浮液里加入一份雙料脫脂牛奶。脫脂牛奶是用200g脫脂奶粉加入lL蒸餾水，然后在121℃下高壓15min制得。
⑦ 將上步所獲得的混合物分裝成l mL~2mL，進(jìn)行凍干處理。
⑧ 可在室溫(2l℃~23℃)條件下保存4~5年。
6．單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉湯或10mL胰蛋白磷酸鹽肉湯。
② 于30℃~35℃培養(yǎng)48h±2h。
③ 再接入含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上。
④ 于30℃~35℃培養(yǎng)48 h±2h。
⑤ 4℃冷藏斜面培養(yǎng)物。
⑥ 每個(gè)月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉湯或10mL胰蛋白磷酸鹽肉湯。
② 于30℃~35℃培養(yǎng)48h±2h。
③ 在肉湯培養(yǎng)物內(nèi)加入甘油使最終濃度達(dá)到10％。
④ 分裝成2 mL~3mL，在-70℃或更低溫度進(jìn)行冷凍。
⑤ 每6個(gè)月傳代。
7．沙門氏菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌接種在腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 將培養(yǎng)物置于室溫(21℃~23℃)，避光環(huán)境。
③ 每?jī)蓚€(gè)星期傳代一次。
（2）長(zhǎng)期保存
保存沙門氏菌不建議使用凍干法，因?yàn)榧?xì)菌的鞭毛和菌體抗原可能會(huì)因此遭到破壞。
① 將菌種接種到血瓊脂斜面，于35℃條件下培養(yǎng)24h±2h。
② 用無菌接種環(huán)（1µL）在斜面的表面收集培養(yǎng)物。
③ 收集到的培養(yǎng)物接種到裝有半固體胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基(不加酚紅)。制做此培養(yǎng)基的方法：溶解20g胰酪胨和3.5g瓊脂到1L水中。分裝1mL~2mL到l0mm×75mm帶金屬箔片蓋的試管內(nèi)。將試管于116℃~118℃滅菌15min。冷卻后，在無菌條件下用軟木塞封好試管口。軟木塞應(yīng)該事先浸泡在煮沸的石蠟里5min。
④ 接種好的試管于35℃培養(yǎng)24h±2h。
⑤ 培養(yǎng)物在室溫(2l℃~23℃)避光處保存。
⑥ 每3年進(jìn)行傳代。
8．志賀氏菌
與大腸桿菌相同。
9．金黃色葡萄球菌
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL胰酪胨大豆肉湯的試管，然后于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 將培養(yǎng)物在胰酪胨大豆瓊脂斜面上劃線，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 室溫保存(21℃~23℃)。
④ 每周傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL胰酪胨大豆肉湯的試管，然后于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 加入甘油使最終濃度達(dá)到20％，分裝成2mL~3mL在-80℃下冷凍?；蛘撸尤胱銐蛄繙缇V物油，將胰酪胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物覆蓋。
③ 對(duì)于以上兩種長(zhǎng)期保存方法，都需要每年進(jìn)行傳代。
④ 還有一種方法是將胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)6h~12h培養(yǎng)物，取出2mL加入滅菌的80％甘油2mL放入凍存管，立即在-70℃進(jìn)行冷凍。每隔6個(gè)月進(jìn)行傳代。
10．霍亂弧菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌深度穿刺接種到T1N1培養(yǎng)基。T1N1培養(yǎng)基制備方法：將10g胰酪胨、10g氯化鈉、20g瓊脂溶解到lL蒸餾水中。分裝4mL到13mm×100mm帶螺旋蓋的試管內(nèi)。121℃，滅菌15min。不需調(diào)pH值。
② 擰松試管蓋進(jìn)行接種，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 將試管蓋擰緊，在4℃下保存。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種入10mL T1N1肉湯，于35℃培養(yǎng)6h~12h。
② 取2mLT1N1培養(yǎng)物加入2mL滅菌80％甘油，裝入凍存管，立即冷凍到-70℃。
③ 每隔6個(gè)月進(jìn)行傳代。
11．副溶血性弧菌
（1）短期保存
① 深度穿刺接種保存培養(yǎng)基。保存培養(yǎng)基制備方法： 3g的酵母浸膏、10g蛋白胨、30g氯化鈉、3g瓊脂，溶解到1L蒸餾水中。分裝4mL到13mmx100mm帶螺旋帽的試管內(nèi)。121℃，滅菌15min。不需調(diào)pH值。
② 擰松試管蓋進(jìn)行接種，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 將試管帽擰緊，室溫(21℃~23℃)保存。不能冷藏。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到含3％氯化鈉(最終濃度)的 10mL胰酪胨大豆肉湯中，于35℃培養(yǎng)6h~12h。
② 在1mL肉湯培養(yǎng)物內(nèi)加入0.09mL滅菌的二甲亞砜，裝入無菌凍存管，立即在-70℃進(jìn)行冷凍。
③ 每6個(gè)月進(jìn)行傳代。
12 創(chuàng)傷弧菌
與副溶血性弧菌相同
13 酵母菌和霉菌
（1）短期保存
在接種前要對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢查看是否被其他酵母菌和霉菌污染?？床磺宄r(shí)，用解剖鏡檢查。
① 在裝有30mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂的平板劃線，平板中添加有酒石酸或抗生素。選擇抗生素比酒石酸好，因?yàn)閮?chǔ)液較易制備，而且不會(huì)引起像pH值較低對(duì)某些酵母菌和霉菌抑制的情況。
酒石酸添加方法：用經(jīng)過0.45μm膜過濾除菌的10％酒石酸溶液調(diào)整瓊脂培養(yǎng)基的pH值至3.5±0.1。用滴定的方法決定調(diào)至pH3.5所用的溶液量。溶液加入培養(yǎng)基以后允許部分培養(yǎng)基凝固，使用酸度計(jì)來檢查pH值。
在抗生素的選擇中，鹽酸四環(huán)素是首選抗生素，有效濃度40mg/L。其他抗生素，例如：氯霉素或鏈霉素也可以使用，濃度和鹽酸四環(huán)素的一樣?？股貎?chǔ)液的制作過程是溶解1g抗生素到100mL無菌蒸餾水中，然后用0.45μm的膜過濾除菌。將儲(chǔ)液存放在4℃~8℃避光處。存儲(chǔ)時(shí)間不要超過1個(gè)月。在使用之前要將儲(chǔ)液提前放到室溫環(huán)境(21℃~23℃)。每配制250mL培養(yǎng)基，加入1mL上述儲(chǔ)液，終濃度即為40 mg/L。
② 于22℃~25℃培養(yǎng)瓊脂平板，直到菌落直徑達(dá)到3 cm~5cm(霉菌大約需要一周，酵母大約需要兩周)。
③ 挑選單菌落接種到加有酒石酸或抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面。
④ 將試管在22℃~25℃培養(yǎng)一周(霉菌)或兩周(酵母菌)。
⑤ 將培養(yǎng)物在4℃進(jìn)行冷藏。
⑥ 每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種加有酒石酸或抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面。
② 在22℃~25℃培養(yǎng)一周(霉菌)或二周(酵母)。
③ 用滅菌礦物油或甘油浸沒瓊脂斜面培養(yǎng)物。
④ 在4℃環(huán)境儲(chǔ)存。
⑤ 每6個(gè)月進(jìn)行傳代。
⑥ 另一種方法是用無菌蒸餾水淹沒正在生長(zhǎng)的瓊脂斜面。渦旋混和使斜面上的孢子或細(xì)胞懸浮。
⑦ 取1mL懸浮液放入裝有5g土壤的試管。(土壤要經(jīng)121℃，滅菌1h)
⑧ 在4℃進(jìn)行儲(chǔ)存。
⑨ 一年進(jìn)行一次傳代。
14．小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌
培養(yǎng)溫度如果超過30℃，或培養(yǎng)的次數(shù)太多，有可能使致病的質(zhì)粒丟失。
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL牛肉浸出肉湯或腦心浸出肉湯的試管，于26℃培養(yǎng)48h±2h。
② 在胰酪胨大豆瓊脂斜面上劃線，培養(yǎng)溫度26℃，時(shí)間為48h±2h。
③ 在室溫避光處儲(chǔ)存。
④ 每月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL牛肉浸出肉湯或腦心浸出肉湯的試管，于26℃培養(yǎng)48h±2h。
② 加入甘油，使最終濃度在10％~20％。
③ 分裝2mL~3mL，在-70℃或更低溫度冷凍。
④ 每4~6個(gè)月進(jìn)行傳代。
以上資料來源網(wǎng)絡(luò)。
菌種保藏管鏈接：http://www.jc6jd.com/chanpin/wswhc/cyhc/jzbcg/60.html
1．蠟樣芽孢桿菌
（1）短期保存
① 接種蠟樣芽孢桿菌于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面并于30℃～35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 在室溫條件下(21℃~23℃)繼續(xù)保持1d~2d以便于芽孢完全生成。
③ 在4℃條件下冷藏肉湯培養(yǎng)物。
（2）長(zhǎng)期保存
① 將蠟樣芽孢桿菌菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，在30℃~35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 在室溫條件下(21℃~23℃)繼續(xù)保持l d~2d，以便于芽孢完全生成。
③ 為了延緩細(xì)菌的生長(zhǎng)，可以用蒸餾水與20％的甘油氯化鈉溶液按l：1混合以后加到瓊脂斜面上。
制備甘油氯化鈉溶液：溶解4.2g的氯化鈉，并加入蒸餾水，使體積達(dá)到800mL。在溶液中加入12.4g的無水磷酸氫二鉀，4.0g無水磷酸二氫鉀和200mL甘油。調(diào)整pH值至7.2，121℃，滅菌5min。
④ 將3mL 1：1的混合液迅速放入干冰中或超低溫冷凍箱內(nèi)進(jìn)行冷凍，溫度設(shè)定在-55℃到-90℃。
⑤ 每?jī)赡辏瓷戏ㄟM(jìn)行培養(yǎng)。
2．空腸彎曲桿菌
所有的培養(yǎng)過程必須使用微需氧的空氣環(huán)境：氮?dú)庹?5％，二氧化碳占l0％，氧氣占5％。
（1）短期保存
① 接種裝有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化鈉肉湯。
配制方法： 20g酸水解酪素（casamino acid）、6g酵母浸膏、2.5g氯化鈉和 8.7lg無水磷酸氫二鉀，補(bǔ)足蒸餾水至1L。121℃，15min滅菌。調(diào)整pH值，使其在滅菌后為8.5±0.2。
② 將接種過的培養(yǎng)基在41℃~44℃培養(yǎng)48 h±2h。
③ 在巧克力瓊脂或血瓊脂斜面上進(jìn)行劃線，41℃~44℃培養(yǎng)48h±2h。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種裝有10mL酸水解酪素－酵母浸膏－氯化鈉肉湯，于4l℃~44℃培養(yǎng)48h±2h。
② 在培養(yǎng)物內(nèi)加入甘油，使最終濃度達(dá)到10％~20％。
③ 分裝2mL~3mL，于-70℃或更低溫度進(jìn)行冷凍。
④ 每6個(gè)月傳代一次。
3．肉毒梭菌
（1）短期保存
① 接種脫氣后的裝有皰肉培養(yǎng)基或含胰蛋白酶的胰酪胨－蛋白胨－葡萄糖－酵母浸膏肉湯（Trypticase-peptone-glucose-yeast extract broth,TPGYT），根據(jù)不同菌株選擇26℃或35℃培養(yǎng)，26℃適于蛋白水解的A、B、F和G群，而35℃適于非蛋白水解的B、E和F群。
制備皰肉培養(yǎng)基：在12.5g的市售培養(yǎng)基內(nèi)加入100mL冷卻的蒸餾水。混合后保持15min，以便使里面所有顆粒都能濕透。另一種辦法是分裝1.25g市售培養(yǎng)基到20mm×150mm的試管內(nèi)，加入10mL涼的蒸餾水，混合均勻，使所有顆粒都浸透。121℃，滅菌20min。最終的pH值為7.2±0.2。
TPGYT培養(yǎng)基無法買到，須用各種不同的原料自己配制。配制過程是在1L蒸餾水內(nèi)溶解以下原料：50g胰酪胨、5g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖和lg硫乙醇酸鈉。分裝15mL到20mm×150mm的試管內(nèi)，121℃，滅菌10min。最終的pH值為7.0±0.2。冷藏滅菌后的培養(yǎng)基，在使用之前加入胰蛋白酶（trypsin）。
制做胰蛋白酶溶液：將1.5g的胰蛋白酶(1：250，Difco)加入100mL蒸餾水中。攪拌水中的胰蛋白酶使其懸起，讓顆粒沉淀，用0.45μm的濾膜過濾上清液。使用之前蒸煮上述基礎(chǔ)液10min，排出溶解氧。在每15mL基礎(chǔ)液里加入1mL胰蛋白酶溶液。
② 根據(jù)培養(yǎng)細(xì)菌所要求的溫度，培養(yǎng)5天或更長(zhǎng)時(shí)間。
③ 在4℃可保存6個(gè)月。
（2）長(zhǎng)期保存
① 按上述方法培養(yǎng)細(xì)菌。
② 用無菌的離心管盛TPGYT培養(yǎng)物離心，沉淀細(xì)菌芽孢。
③ 用10mL~20mL無菌蒸餾水沖洗細(xì)菌芽孢兩次。
④ 用無菌蒸餾水重懸洗過的芽孢，將其儲(chǔ)存于4℃。
⑤ 細(xì)菌芽孢懸液能穩(wěn)定保存10年～20年。
4．產(chǎn)氣莢膜梭菌
（1）短期保存
① 試管內(nèi)裝入10mL新脫氣過的液體硫乙醇酸鹽肉湯，接種入產(chǎn)氣莢膜梭菌，在35℃~37℃厭氧條件下培養(yǎng)18h～20h。
② 再將細(xì)菌接入脫氣后的皰肉培養(yǎng)基，在35℃~37℃有氧條件下培養(yǎng)24h±2h。
③ 在室溫環(huán)境(21℃~23℃)再培養(yǎng)1d~2d，使芽孢充分形成。
④ 在4℃條件下冷藏肉湯培養(yǎng)物。
⑤ 每30天進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種產(chǎn)氣莢膜梭菌到胰酪胨-蛋白胨-葡萄糖-酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基。
配制方法：將50.0g胰酪胨、5.0g蛋白胨、20g酵母浸膏、4g葡萄糖、5g磷酸氫二鈉和lg硫乙醇酸鈉溶解到1L蒸餾水中。調(diào)整pH值為7.3±0.2，分裝15mL到20mm×150mm的試管內(nèi)，121℃，滅菌8min。使用之前將滅菌后的培養(yǎng)基冷藏保存。
② 將接種過的培養(yǎng)基于35℃~37℃培養(yǎng)18h。
③ 按1:1的量將肉湯培養(yǎng)物加入到脫脂奶中，取lmL～2mL進(jìn)行凍干?；蛘甙?:1的量將肉湯培養(yǎng)物加入到10％甘油氯化鈉溶液中。甘油氯化鈉溶液的制備：溶解4.2g氯化鈉到900mL蒸餾水中。然后加入12.2g無水磷酸氫二鉀、4g無水磷酸二氫鉀和100mL甘油。調(diào)整pH值到7.2±0.2，然后在121℃，滅菌15min。
④ 取1mL～3mL1:1的培養(yǎng)物混合物，放入固體干冰中和超低溫冰箱中保存，溫度為-55℃～-90℃。
⑤ 每?jī)赡陚鞔淮巍?/span>
5．大腸桿菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌接種到腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 在4℃冷藏斜面培養(yǎng)物。
③ 每月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 將細(xì)菌接種到腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24±2h。
② 將上述培養(yǎng)物接種到l0mL腦心浸液中。
③ 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，時(shí)間為24±2h。
④ 離心培養(yǎng)液，然后用l0mL巴氏磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞兩遍。
⑤ 用10mL巴氏磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞。
⑥ 在一份沖洗過的細(xì)胞懸浮液里加入一份雙料脫脂牛奶。脫脂牛奶是用200g脫脂奶粉加入lL蒸餾水，然后在121℃下高壓15min制得。
⑦ 將上步所獲得的混合物分裝成l mL~2mL，進(jìn)行凍干處理。
⑧ 可在室溫(2l℃~23℃)條件下保存4~5年。
6．單核細(xì)胞增生李斯特氏菌
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉湯或10mL胰蛋白磷酸鹽肉湯。
② 于30℃~35℃培養(yǎng)48h±2h。
③ 再接入含0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上。
④ 于30℃~35℃培養(yǎng)48 h±2h。
⑤ 4℃冷藏斜面培養(yǎng)物。
⑥ 每個(gè)月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌于10mL含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉湯或10mL胰蛋白磷酸鹽肉湯。
② 于30℃~35℃培養(yǎng)48h±2h。
③ 在肉湯培養(yǎng)物內(nèi)加入甘油使最終濃度達(dá)到10％。
④ 分裝成2 mL~3mL，在-70℃或更低溫度進(jìn)行冷凍。
⑤ 每6個(gè)月傳代。
7．沙門氏菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌接種在腦心浸液瓊脂斜面，于35℃培養(yǎng)24 h±2h。
② 將培養(yǎng)物置于室溫(21℃~23℃)，避光環(huán)境。
③ 每?jī)蓚€(gè)星期傳代一次。
（2）長(zhǎng)期保存
保存沙門氏菌不建議使用凍干法，因?yàn)榧?xì)菌的鞭毛和菌體抗原可能會(huì)因此遭到破壞。
① 將菌種接種到血瓊脂斜面，于35℃條件下培養(yǎng)24h±2h。
② 用無菌接種環(huán)（1µL）在斜面的表面收集培養(yǎng)物。
③ 收集到的培養(yǎng)物接種到裝有半固體胰酪胨瓊脂培養(yǎng)基(不加酚紅)。制做此培養(yǎng)基的方法：溶解20g胰酪胨和3.5g瓊脂到1L水中。分裝1mL~2mL到l0mm×75mm帶金屬箔片蓋的試管內(nèi)。將試管于116℃~118℃滅菌15min。冷卻后，在無菌條件下用軟木塞封好試管口。軟木塞應(yīng)該事先浸泡在煮沸的石蠟里5min。
④ 接種好的試管于35℃培養(yǎng)24h±2h。
⑤ 培養(yǎng)物在室溫(2l℃~23℃)避光處保存。
⑥ 每3年進(jìn)行傳代。
8．志賀氏菌
與大腸桿菌相同。
9．金黃色葡萄球菌
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL胰酪胨大豆肉湯的試管，然后于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 將培養(yǎng)物在胰酪胨大豆瓊脂斜面上劃線，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 室溫保存(21℃~23℃)。
④ 每周傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL胰酪胨大豆肉湯的試管，然后于35℃培養(yǎng)24h±2h。
② 加入甘油使最終濃度達(dá)到20％，分裝成2mL~3mL在-80℃下冷凍?；蛘撸尤胱銐蛄繙缇V物油，將胰酪胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物覆蓋。
③ 對(duì)于以上兩種長(zhǎng)期保存方法，都需要每年進(jìn)行傳代。
④ 還有一種方法是將胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)6h~12h培養(yǎng)物，取出2mL加入滅菌的80％甘油2mL放入凍存管，立即在-70℃進(jìn)行冷凍。每隔6個(gè)月進(jìn)行傳代。
10．霍亂弧菌
（1）短期保存
① 將細(xì)菌深度穿刺接種到T1N1培養(yǎng)基。T1N1培養(yǎng)基制備方法：將10g胰酪胨、10g氯化鈉、20g瓊脂溶解到lL蒸餾水中。分裝4mL到13mm×100mm帶螺旋蓋的試管內(nèi)。121℃，滅菌15min。不需調(diào)pH值。
② 擰松試管蓋進(jìn)行接種，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 將試管蓋擰緊，在4℃下保存。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種入10mL T1N1肉湯，于35℃培養(yǎng)6h~12h。
② 取2mLT1N1培養(yǎng)物加入2mL滅菌80％甘油，裝入凍存管，立即冷凍到-70℃。
③ 每隔6個(gè)月進(jìn)行傳代。
11．副溶血性弧菌
（1）短期保存
① 深度穿刺接種保存培養(yǎng)基。保存培養(yǎng)基制備方法： 3g的酵母浸膏、10g蛋白胨、30g氯化鈉、3g瓊脂，溶解到1L蒸餾水中。分裝4mL到13mmx100mm帶螺旋帽的試管內(nèi)。121℃，滅菌15min。不需調(diào)pH值。
② 擰松試管蓋進(jìn)行接種，于35℃培養(yǎng)24h±2h。
③ 將試管帽擰緊，室溫(21℃~23℃)保存。不能冷藏。
④ 每周進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到含3％氯化鈉(最終濃度)的 10mL胰酪胨大豆肉湯中，于35℃培養(yǎng)6h~12h。
② 在1mL肉湯培養(yǎng)物內(nèi)加入0.09mL滅菌的二甲亞砜，裝入無菌凍存管，立即在-70℃進(jìn)行冷凍。
③ 每6個(gè)月進(jìn)行傳代。
12 創(chuàng)傷弧菌
與副溶血性弧菌相同
13 酵母菌和霉菌
（1）短期保存
在接種前要對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢查看是否被其他酵母菌和霉菌污染?？床磺宄r(shí)，用解剖鏡檢查。
① 在裝有30mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂的平板劃線，平板中添加有酒石酸或抗生素。選擇抗生素比酒石酸好，因?yàn)閮?chǔ)液較易制備，而且不會(huì)引起像pH值較低對(duì)某些酵母菌和霉菌抑制的情況。
酒石酸添加方法：用經(jīng)過0.45μm膜過濾除菌的10％酒石酸溶液調(diào)整瓊脂培養(yǎng)基的pH值至3.5±0.1。用滴定的方法決定調(diào)至pH3.5所用的溶液量。溶液加入培養(yǎng)基以后允許部分培養(yǎng)基凝固，使用酸度計(jì)來檢查pH值。
在抗生素的選擇中，鹽酸四環(huán)素是首選抗生素，有效濃度40mg/L。其他抗生素，例如：氯霉素或鏈霉素也可以使用，濃度和鹽酸四環(huán)素的一樣?？股貎?chǔ)液的制作過程是溶解1g抗生素到100mL無菌蒸餾水中，然后用0.45μm的膜過濾除菌。將儲(chǔ)液存放在4℃~8℃避光處。存儲(chǔ)時(shí)間不要超過1個(gè)月。在使用之前要將儲(chǔ)液提前放到室溫環(huán)境(21℃~23℃)。每配制250mL培養(yǎng)基，加入1mL上述儲(chǔ)液，終濃度即為40 mg/L。
② 于22℃~25℃培養(yǎng)瓊脂平板，直到菌落直徑達(dá)到3 cm~5cm(霉菌大約需要一周，酵母大約需要兩周)。
③ 挑選單菌落接種到加有酒石酸或抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面。
④ 將試管在22℃~25℃培養(yǎng)一周(霉菌)或兩周(酵母菌)。
⑤ 將培養(yǎng)物在4℃進(jìn)行冷藏。
⑥ 每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種加有酒石酸或抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面。
② 在22℃~25℃培養(yǎng)一周(霉菌)或二周(酵母)。
③ 用滅菌礦物油或甘油浸沒瓊脂斜面培養(yǎng)物。
④ 在4℃環(huán)境儲(chǔ)存。
⑤ 每6個(gè)月進(jìn)行傳代。
⑥ 另一種方法是用無菌蒸餾水淹沒正在生長(zhǎng)的瓊脂斜面。渦旋混和使斜面上的孢子或細(xì)胞懸浮。
⑦ 取1mL懸浮液放入裝有5g土壤的試管。(土壤要經(jīng)121℃，滅菌1h)
⑧ 在4℃進(jìn)行儲(chǔ)存。
⑨ 一年進(jìn)行一次傳代。
14．小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌
培養(yǎng)溫度如果超過30℃，或培養(yǎng)的次數(shù)太多，有可能使致病的質(zhì)粒丟失。
（1）短期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL牛肉浸出肉湯或腦心浸出肉湯的試管，于26℃培養(yǎng)48h±2h。
② 在胰酪胨大豆瓊脂斜面上劃線，培養(yǎng)溫度26℃，時(shí)間為48h±2h。
③ 在室溫避光處儲(chǔ)存。
④ 每月進(jìn)行傳代。
（2）長(zhǎng)期保存
① 接種細(xì)菌到裝有10mL牛肉浸出肉湯或腦心浸出肉湯的試管，于26℃培養(yǎng)48h±2h。
② 加入甘油，使最終濃度在10％~20％。
③ 分裝2mL~3mL，在-70℃或更低溫度冷凍。
④ 每4~6個(gè)月進(jìn)行傳代。
以上資料來源網(wǎng)絡(luò)。
菌種保藏管鏈接：http://www.jc6jd.com/chanpin/wswhc/cyhc/jzbcg/60.html
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